生物體內(nèi)存在的機(jī)械力，比如流體剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有著非常多的影響。在血管中，不規(guī)則的亂流通常和血管的疾病（比如，動(dòng)脈粥樣硬化）是相關(guān)的，并且能直接影響內(nèi)皮細(xì)胞的分化和凋亡。因此，2015年，瑞士的一個(gè)研究小組在淋巴管中研究不規(guī)則的剪切力的作用中發(fā)現(xiàn)，不規(guī)則的剪切力和轉(zhuǎn)錄因子FOXC2共同在在淋巴管形成中有著非常關(guān)鍵的作用。在體外培養(yǎng)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中，F(xiàn)OXC2受到振蕩剪切力的刺激會(huì)高表達(dá)，并且增強(qiáng)細(xì)胞間的聯(lián)系，降低細(xì)胞的增殖率；而FOXC2的失活會(huì)使細(xì)胞對(duì)不規(guī)則的剪切力敏感，使細(xì)胞連接分解并且促進(jìn)細(xì)胞增值。文中，研究人員選擇4dyn/cm2每4秒變換流向的振蕩流（OSS，oscillatory shear stress)來模擬體內(nèi)不規(guī)則的亂流。
一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備
1）細(xì)胞： lymphatic endothelial cells (LECs)
2）抗體：FOXC2 （大鼠抗人/小鼠，由Dr.N.Miura贈(zèng)送，Miura et al, 1997, Genomics）
VE-cadherin (山羊抗人/小鼠，R&D（#AF1002））
Ki67 (兔抗人/小鼠，Abcam（#ab15580）
二抗 （Alexa 488-conjugated，Alexa 555-conjugate，Alexa 647-conjugated， Life Technologies）
3）培養(yǎng)耗材：ibidi單通道載玻片μ-Slide I0.8 Luer （ibidi，Germany，80196）
灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）
封口夾
4）儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）
二、實(shí)驗(yàn)方法
在實(shí)驗(yàn)開始前一天，請(qǐng)將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過夜，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。
按照下面流程鋪細(xì)胞：
1）將LECs細(xì)胞懸液加入通道載玻片中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細(xì)胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細(xì)胞懸液充滿整個(gè)通道（圖一）。
2）蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時(shí)，等待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個(gè)注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基（圖二）
3）將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)左右，等到細(xì)胞剛剛長(zhǎng)滿為單細(xì)胞層，即可開始實(shí)驗(yàn)。注意，要使用單層細(xì)胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗(yàn)，使每個(gè)細(xì)胞均受到均勻的剪切力。
4）靜置條件下細(xì)胞培養(yǎng)。在通道載玻片中靜置培養(yǎng)的細(xì)胞可以作為流體剪切力條件下培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)照。待流體實(shí)驗(yàn)開始的同時(shí)，將靜置細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)照組放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行2天的培養(yǎng)。注意，培養(yǎng)過程中每天都要更換培養(yǎng)基。
二）搭建流體系統(tǒng)
1）將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲(chǔ)液管中加入12ml培養(yǎng)基。這時(shí)不需要連接通道載玻片。實(shí)驗(yàn)前需要去除整個(gè)灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會(huì)影響剪切力的大小，有時(shí)還會(huì)使灌流系統(tǒng)中的液體流動(dòng)停滯。打開ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動(dòng)運(yùn)行下面任務(wù)，用于去除氣泡。（表一）
2）連接通道載玻片。去除氣泡后，就可以將之前準(zhǔn)備好的含貼壁細(xì)胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統(tǒng)中取下，放到超凈臺(tái)中。將通道載玻片的注液孔用培養(yǎng)基裝至過滿狀態(tài)( ）。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片（圖四）。
圖四：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個(gè)魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產(chǎn)生氣泡，會(huì)有部分培養(yǎng)基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l）全部連接好后，用顯微鏡觀測(cè)一下通道內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)。
3）檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲(chǔ)液管液面不會(huì)下降或者上升，那么，整個(gè)系統(tǒng)就是密封的，并且是正確安裝的（圖五）。
圖五
三）振蕩剪切力刺激，免疫熒光染色
1) 以4 dynes/cm2；0.25 Hz（每4秒變換一次方向）刺激LECs細(xì)胞，進(jìn)行48小時(shí)的培養(yǎng)。靜置對(duì)照是直接將鋪有LECs的通道載玻片直接放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，每天換一次液。
2) Ibidi通道載玻片具有非常好的顯微成像效果，可以直接在通道內(nèi)對(duì)處理的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，并且成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，輕輕吸出培養(yǎng)基，PBS清洗。
3) 每通道以200μl的4%的多聚甲醛固定10分鐘，用PBS清洗。
4) 每通道加入200μl的0.1% Triton® X-100通透3-5分鐘，用PBS清洗。
5) 每通道加入200μl的1%BSA封閉20分鐘，用PBS清洗后，直接吸出所有液體。
6) 在通道未干之前加入一抗，二抗，進(jìn)行常規(guī)的免疫熒光操作。
7) 加入封片液，鏡檢觀測(cè)。
三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在振蕩剪切力的刺激下，研究人員檢測(cè)了FOXC2和細(xì)胞增殖生物標(biāo)記物Ki67的表達(dá)情況。從圖上可見，在OSS的刺激下，F(xiàn)OXC2有非常顯著的表達(dá)（粉色）而，代表細(xì)胞增殖的Ki67的表達(dá)則顯著下降。與此同時(shí)針對(duì)VE-cadherin細(xì)胞聯(lián)合的染色表明，在有OSS刺激的情況下，VE-cadherin細(xì)胞聯(lián)合的面積明顯變大。
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